公告信息：
在生物體內，生物大分子的氧化是一個由自由基介導的必要的生理過程。但是過量的自由基則會給細胞帶來傷害甚至死亡，導致癌癥、中風、糖尿病及心肌梗塞等疾病的發生。已有研究表明，食物來源的生物活性肽具有在體內清除自由基的能力，并且比合成的抗氧化劑更安全．目前，對食物蛋白質來源的酶水解物的抗氧化性研究主要集中在大豆蛋白、小麥蛋白、鹿茸和魚等，而對核桃蛋白水解物抗氧化性的研究報道則較少．本文以堿性蛋白酶(Alcalase2．4L)水解核桃蛋白，對獲得的水解產物進行了葡聚糖凝膠柱和反相層析分離純化，測定了水解物對DPPH和羥自由基的清除能力，探討了核桃蛋白水解物的抗氧化活性；對抗氧化能力強的多肽采用LC．ESI—Q—TOF鑒定了其一級序列。
1實驗部分
1．1材料、試劑與儀器
核桃購自長春沃爾瑪超市；堿性蛋白酶Alcalase2．4L購自丹麥Novozymes公司；HPLC級乙腈購自美國Fisher公司；1，1-diphenyl-2一picrylhydrazyl(DPPH)，L-glutathionereduced(GSH)購自Sigma公司。
WatersAlliance2695高效液相色譜系統；Waters2996二極管陣列檢測器；RRLC—Q—TOF6520質譜儀(Agilent公司)；ZORBAXExtend—C18色譜柱(1．8um，2．1mmxl50mm，Agilent公司)；多功能酶標儀(Tecan公司)。
1．2核桃蛋白酶解物的制備與分離純化
1．2．1核桃蛋白的制備將核桃去皮粉碎過40目篩，用石油醚脫脂2次(料液體積比1：10)；用NaOH調節pH=9．0，于45℃孵育lh，以3500r／min轉速離心30min，取上清液調節pH=4．5后靜置，以3500rmin轉速離心30min，將沉淀用水洗至中性，凍干即得核桃蛋白。
1．2．2核桃蛋白酶解物的制備取一定量的核桃蛋白用水溶解(質量分數3％)，用0．5mol／LNaOH調節反應體系pH=8．0，于50℃恒溫振蕩反應。將50℃預熱的堿性蛋白酶(Alcalase2．4L)加人到反應體系中，啟動酶解反應；反應過程中加入NaOH以維持反應體系的pH值。反應3h后，于90℃水浴保持10rain，使酶失活；以3500r／min轉速離心30rain，上清液即為核桃蛋白酶解物。
1．2．3核桃蛋白酶解物的分離純化將核桃蛋白酶解物用截留分子量(MWCO)為3000的超濾管進行超濾，超濾組分進行抗氧化實驗．對核桃蛋白酶解物超濾后抗氧化強的組分進一步用SephadexG-25凝膠層析柱分離純化，收集各組分、凍干，進行抗氧化實驗篩選．取SephadexG-25純化后抗氧化活性最強的組分進一步用HPLC純化，收集各組分、凍干，進行抗氧化實驗篩選．
1．3核桃蛋白酶解物的抗氧化活性研究
1．3．1DPPH清除能力(DRSA)實驗參照文獻方法測定酶解物的DPPH清除能力，DPPH清除能力按下式計算：
式中，As為蛋白酶解物的吸光度；Ab為樣品背景的吸光度(不加DPPH)；Ac為對照管的吸光度(水代替樣品)．
1．3．2羥基自由基(·OH)清除能力(HRSA)實驗參照文獻方法測定酶解物的羥基自由基清除能力，羥自由基清除能力按下式計算：
式中，A8為蛋白酶解物的吸光度；A1為損傷管的吸光度(水代替樣品)；A0為未損傷管的吸光度(水代替雙氧水)．
1．3．3還原力的測定參照文獻方法，以酶解物還原三價鐵為二價鐵，用鐵氰化鉀檢測二價鐵，溶液在500nin處有吸收，吸光度值與還原力成正比．
1．4核桃蛋白酶解多肽的序列鑒定
將HPLC純化后抗氧化活性最強的組分先用UPLC測定其純度，再用LC．ESI-Q．TOF手段鑒定肽段的一級序列．
UPLC條件：流動相A為超純水[含0．1％甲酸(體積分數)]，流動相B為乙腈；梯度洗脫：5％-50％B(0～14min)；柱溫30oC；流速0．3mL／min；進樣量10ul測序色譜條件：流動相A為超純水[含0．1％甲酸(體積分數)]，流動相B為乙腈；梯度洗脫：5％～70％B(O一20min)，70％B(20—25rain)；柱溫30℃；流速0．3mL／min；進樣量10斗ul。
測序質譜條件：電噴霧正離子電離模式，質量掃描范圍m／z50～2000，氣體溫度350oC，干燥氣流速9L／min，噴霧氣壓0．28MPa，毛細管電壓3．5kV，裂解電壓150V，錐孔電壓65V．利用PeaksViewer4．5軟件(BioinformaticsSolutionsInc．)和手動計算相結合的方式鑒定多肽序列．
2結果與討論
2．1核桃蛋白酶解物的分離與純化
利用超濾管超濾核桃蛋白酶解物后，用DPPH清除實驗及羥基自由基清除實驗來檢測酶解物分子量分別大于和小于3000的組分的抗氧化活性．結果表明，酶解物分子量小于3000的組分具有更強的抗氧化能力，故取此組分進行下一步分離純化．經SephadexG-25分離純化共獲得4個主要洗脫峰F1，F2，F3和F4[圖1(A)]；經抗氧化實驗[圖1(B)]發現F2具有更強的抗氧化活性．收集砣組分，凍干后進一步利用HPL純化[圖2(A)]，發現F2-5抗氧化活性最強，多次收集，凍干2．2核桃蛋白酶解物的抗氧化活性DPPH自由基清除能力測定是一種常見的篩選和評價抗氧化劑活性的有效方法．DPPH是一種較為穩定的自由基，分子結構中有未成對電子，其乙醇溶液呈藍紫色，在517nm處有最大吸收值．當未成對電子被其它自由基電子配對后，吸收值降低，其褪色程度與所接受的電子數呈定量關系．當與抗自由基活性物質反應時，溶液顏色變淺，吸收值降低．吸收值越低表明該物質的抗自由基活性越強．羥基自由基清除力的測定選用鄰二氮菲法，以H：0：／Fe2+體系通過Fenton反應產生羥自由基，總反應可表示如下：
Fe2++H202—_Fe3++OH一+·OH鄰二氮菲一Fe2+水溶液被羥自由基氧化為鄰二氮菲一Fe3+后，其515nm吸收峰明顯降低，根據以上原理，變化反映羥自由基的氧化作用．
圖1(B)和圖2(B)分別為核桃蛋白酶解物經過SephadexG-25純化后的4個組分(F1，砣，F3和F4)和組分F2經過HPLC分離純化后各組分的DP—PH和羥基自由基清除力測定結果．圖1(‘B)顯示，4個組分均具較好的DPPH和羥基自由基清除力，其中F2的抗氧化能力最強．圖2(B)顯示，F2-5的DPPH和羥基自由基清除力最強，收集多次凍干，分別用于測定還原力實驗和多肽序列．
圖3為組分F2-5．、陽性對照還原型谷胱甘肽(GSH)及二丁基羥基甲苯(BHT)的還原力實驗結果。樣品的抗氧化能力與還原力密切相關，19J還原力越強則吸光度值越大。隨著F2-5、谷胱甘肽和二丁羥基甲苯濃度的增大，還原力逐漸增強；當F2-5濃度為1mg／mL時還原力達到1．5，與谷胱甘肽相當，說明F2—5具有較好的還原力．
2．3核桃蛋白酶解多肽的序列鑒定
將F2-5凍干樣品用水溶解，先用液相色譜測定其純度，結果顯示譜圖中(圖4)只有1個峰，可見其為純品；再利用液相色譜一質譜進行序列鑒定．MS／MS圖譜利用專業軟件Peaks的denovo功能進行分析，所得結果再手動計算確認，結果如圖5所示．F2-5的氨基酸序列為A1a-Gly—Gly—A1a．Chen等M’2叫和Sampath等指出，活性肽中疏水性氨基酸有利于增加脂溶性，抑制油脂的氧化；甘氨酸的側鏈只有1個氫原子，多肽骨架具有較高的靈活度，有利于增加多肽的抗氧化能力舊，故本文中的活性肽也具有一定的抗氧化活性．
3結論
核桃蛋白質通過堿性蛋白酶水解后得到的酶解物具有較強的抗氧化活性；經過多步分離純化后得到多肽Ala—Gly—Gly—Ala，其還原力和谷胱甘肽相當．本文為進一步研究核桃多肽的抗氧化機理及核桃的深加工提供了一定的理論和實驗依據，為核桃作為抗氧化的保健品及藥品食品添加劑的開發提供了思路。
